原标题：《【前沿科普】CRISPR-Cas12a：一款强有力的检测识别工具》

　　CRISPR-Cas12a技术在检测方面具有一定突出优势，但CRISPR-Cas12a检测法在推广的同时也不可避免地存在着一些技术障碍方面的缺陷。目前扩增及检测被应用到多种病原体检测策略中★■，将扩增子转移到检测平台是一个必要步骤，不过在此过程中易产生气溶胶及造成其他类型的污染。由于在实际应用中遇到的食品■◆◆、动物和病理样品组成复杂◆★，需要检测的核酸浓度可能较低，因此样品预处理这一环节至关重要[8]。除此之外对检测所需的仪器、设备、环境等方面的要求也同样不容忽视，需依据实际情况来决定是否可行并选择最佳方案。

　　目前所流行的Cas9与Cas12a系统均属于2类，CRISPR-Cas12a为一种由crRNA所引导的内切酶■★◆■，是一种RNA引导的系统◆■■，被归类为Ⅴ型。CRISPR-Cas12a系统在病原体检测中的应用包括两个阶段：1.检测样本的核酸扩增和构建◆◆◆■★■；2★★★★◆.反应和CRISPR系统的演示。采用PCR、等温扩增等低成本技术扩增核酸分子，而CRISPR系统的指数扩增、快速识别和裂解提高了检测效率。CRISPR-Cas12a系统的显示部分可用荧光信号★★◆★◆、LFA条带■■★■■★、芯片等■★★◆■★，使检测结果更容易理解甚至可视化，并且还能够进行多重检测以提高检测效率。将不同类型crRNA与Cas酶结合★■■，使用同一系统可同时检测多个靶点[3]。CRISPR-Cas12a系统的免疫流程如下图所示。

　　用于基因组操作的CRISPR-Cas技术的出现和快速发展对生命科学来说是革命性的。随着CRISPR-Cas工具包的不断应用，在生物传感器领域出现了新的亮点，这对于检测领域来说既是机遇又是挑战★■■★★◆。在CRISPR-Cas12系列中，CRISPR-Cas12a的使用次数最多，CRISPR-Cas12a的检测法已逐步推广，随着功能核酸和细菌变构转录因子的出现，使得CRISPR-Cas12a能够应用于检测各种靶标。将CRISPR-Cas12a与LAMP■■、RPA等各种等温扩增（IA）技术相结合的检测法可以实现对核酸的超灵敏检测，并且具有价格合理■◆◆■、携带方便、快速等优势，非常适合在现场使用。如运用CRISPR-Cas12a技术所研发的核酸试纸条已实现布鲁氏菌感染菌株中野毒株和S2疫苗株的鉴别诊断，可用于布鲁氏菌感染菌株现场筛查，准确捕杀真正感染布鲁氏菌的动物（图2）。此外在表1中还列举出了另外几种运用CRISPR-Cas12a技术研发出的新型检测技术★★。

　　CRISPR-Cas12a是CRISPR-Cas12家族中使用最频繁的一种◆★，由于顺势疗法和反切割特性，它为生物传感器设计提供了多种选择■◆★。由于受体可用性和实用性的限制，基于CRISPR-Cas12a的生物传感器的特异性和灵敏度还有待进一步提高。此外新开发的基于CRISPR-Cas12a的应用和方法推动了众多诊断和检测解决方案的发展腾博诚信为本官网网址★★■，CRISPR/Cas12a与其他IA技术相结合的检测结果表明，CRISPR/Cas12a联合IA技术的检测法在开发下一代核酸检测生物传感器★★■◆、医疗诊断、环境监测等方面具有巨大的潜力。总之，CRISPR-Cas12a技术彻底改变了对细菌的研究。我们预计新的CRISPR技术的发现将会进一步增强我们对生命的理解，以及对生物体进行基因改造的能力■■◆◆■。（详情请点击下方阅读原文）

　　CRISPR系统主要由CRISPR簇（相似长度的重复序列加上间隔序列）■◆■★★、前导序列L和CRISPR相关的Cas蛋白（CRISPR-Cas）组成◆■★。CRISPR重复序列与Cas蛋白密切相关，Cas蛋白在细菌和古细菌中构成适应性免疫系统，用来保护它们免受外来MGE的影响。在细菌免疫系统中，CRISPR-Cas免疫主要由适应、表达、干扰三个阶段组成。第一个阶段（适应阶段）CRISPR系统将入侵病毒等外来DNA片段或质粒作为间隔物插入CRISPR簇中，与人类免疫系统中的记忆细胞类似★★◆；第二个阶段（表达阶段）CRISPR簇被转录成前体RNA，经过加工后成为成熟的CRISPR RNA（crRNA），类似于人类免疫系统的B细胞产生的特异性抗体；第三个阶段（干扰阶段）crRNA引导Cas蛋白形成更大的核糖白复合物，特异性靶向并切割同源病毒或是质粒的核酸★■★◆★。这类似于人体两次感染同一病原体，在两种情况下都导致抗原-抗体结合。

　　CRISPR-Cas系统共分为两个大类◆★◆■◆■，再往下又可细分为六种类型（Ⅰ类~Ⅵ类）和33个亚型[2]◆★■★★。其中1类系统（Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型）在其CRISPR核糖白效应物核酸酶中使用多个Cas蛋白，而2类系统（Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型）使用单个Cas蛋白。1类CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌当中最为常见，所占比例在所有已鉴定CRISPR-Cas基因座中高达90%。2类CRISPR-Cas系统包括剩余的10%几乎只存在于细菌中，并组装成一个核糖-白复合物，由crRNA与Cas蛋白组成◆★★■■■，crRNA包含靶向特定DNA序列的信息◆■■◆★。

　　簇状规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats★★■■■◆，CRISPR）★◆■◆★★，是日本研究人员于1987年在K19大肠杆菌（i）的碱性磷酸酶基因附近找到的串联重复序列间隔序列★◆■，后来又发现它在细菌等原核生物中广泛存在[1]，2002年才被正式命名为CRISPR◆★★■。CRISPR起源于细菌和古细菌的适应性免疫系统，是原核生物现如今已发展出的一种适应性免疫系统，用以对抗质粒■★★、噬菌体等外来移动遗传因子（mobile genetic element, MGE）的攻击★★★■◆◆，被称作是一种★■“基因武器”腾博诚信为本官网网址。而细菌利用CRISPR系统阻止噬菌体的入侵这一现象则是在2007年被发现的■★■◆◆◆。从认识到CRISPR系统是细菌的天然免疫系统以来◆★■◆，科学界对CRISPR系统的研究日益增加。

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